“Dissecting the role of neurogenic factors in Arrhythmogenic Cardiomyopathy”
Principal Investigator: Prof.ssa Cristina Basso

Arrhythmogenic Cardiomyopathy (AC) is a genetic cardiac disorder, mainly caused by mutations in desmosomal genes, and represents one of the main causes of stress-related arrhythmic sudden cardiac death (SCD) in the young and athletes. AC hearts are hallmarked by inflammation and fibro-fatty lesions, which represent a pro-arrhythmogenic substrate. AC pathogenesis is still nebulous and efficacious treatments are sorely missing. Thus, identification of mechanistic therapies to prevent SCD is an unmet need demanding to approach AC from a new perspective.

Our data and the evidence that almost all cardiac and extracardiac cells express desmosomal proteins, lead us to conceptualize ‘AC as a disease of desmosomal proteins NOT of desmosomes’, and as such as a multicellular condition, developing from the aberrant intercellular crosstalk within the heart and among different systems. In detail, we aim at increasing the understanding of disease mechanisms, by revealing the effects of AC mutations on cardiomyocytes (CMs) and immune cells, coordinated by cardiac sympathetic neurons (cSNs), via noradrenaline (NA) and the poorly studied Neuropeptide-Y (NPY).

We hypothesize that interference with specific SN neurotransmitters may contrast multiple factors involved in AC heart remodeling. In strong support of our tenet, NPY triggers adipogenesis in AC cardiac stromal cells, which are adipogenic sources in human AC hearts, and their differentiation can be blocked with FDA-approved NPY-receptor antagonists. Sympathetic innervation is altered in murine and human AC hearts and, notably, cSN ablation prevents heart remodeling and dysfunction in AC mice.

In WP1, molecular, electrophysiological assays and live imaging experiments will evaluate the primary effects of AC mutations on SNs and address whether mutant cSNs may, through altered signaling to targeted cells, contribute to myocardial remodeling. This will be investigated in vitro by optogenetic interrogation of SN-CM communication, using both murine cells and human organoids-on-a-chip, and 3D reconstruction of the SN network in clarified murine and human hearts. Based on our strong data, in a step towards translability, we will test the therapeutic effect of NPY/NA antagonism in vivo, as administered systemically or through inhaled nanocarriers (WP2). By combining large-scale proteomic and transcriptomic analytics, in vitro high-throughput screening and BM transplantation in newly-generated mouse models, WP3 will define the role of AC mutations on immune cell biology and on SN-immune cells crosstalk. Results will be controlled by analysis of myocardial and liquid biopsies, autoptic heart samples, and existing AC specimens collected at the institute of pathologic anatomy of Padova.

Our results will increase the knowledge on AC pathogenesis, opening to identify novel therapeutic targets and develop mechanistic therapies to improve cardiovascular health and reduce mortality in the young population.

  “Analisi del ruolo dei fattori neurogeni nella cardiomiopatia aritmogena”
Responsabile Scientifico: Prof.ssa Cristina Basso

La cardiomiopatia aritmogena (AC) è un disturbo cardiaco genetico causato principalmente da mutazioni nei geni desmosomiali e rappresenta una delle principali cause di morte cardiaca improvvisa aritmica (SCD) correlata allo stress nei giovani e negli atleti. I cuori con AC sono caratterizzati da infiammazione e lesioni fibro-adipose, che rappresentano un substrato pro-aritmogeno. La patogenesi dell'AC è ancora nebulosa e mancano trattamenti efficaci. Pertanto, l'identificazione di terapie meccanicistiche per prevenire la SCD è un'esigenza insoddisfatta che richiede di affrontare l'AC da una nuova prospettiva. I nostri dati e l'evidenza che quasi tutte le cellule cardiache ed extracardiache esprimono proteine desmosomiali, ci portano a concettualizzare "l'AC come una malattia delle proteine desmosomiali NON dei desmosomi" e, in quanto tale, come una condizione multicellulare, che si sviluppa dall'aberrante dialogo intercellulare all'interno del cuore e tra diversi sistemi. In dettaglio, puntiamo ad aumentare la comprensione dei meccanismi della malattia, rivelando gli effetti delle mutazioni AC sui cardiomiociti (CM) e sulle cellule immunitarie, coordinati dai neuroni simpatici cardiaci (cSN), tramite noradrenalina (NA) e il poco studiato Neuropeptide-Y (NPY). Ipotizziamo che l'interferenza con specifici neurotrasmettitori SN possa contrastare molteplici fattori coinvolti nel rimodellamento cardiaco AC. A forte sostegno del nostro principio, NPY innesca l'adipogenesi nelle cellule stromali cardiache AC, che sono fonti adipogeniche nei cuori AC umani, e la loro differenziazione può essere bloccata con antagonisti del recettore NPY approvati dalla FDA. L'innervazione simpatica è alterata nei cuori AC murini e umani e, in particolare, l'ablazione cSN previene il rimodellamento cardiaco e la disfunzione nei topi AC.

Nel WP1, saggi molecolari, elettrofisiologici ed esperimenti di imaging dal vivo valuteranno gli effetti primari delle mutazioni AC sugli SN e affronteranno se i cSN mutanti possano, attraverso una segnalazione alterata alle cellule bersaglio, contribuire al rimodellamento miocardico. Ciò sarà studiato in vitro mediante interrogazione optogenetica della comunicazione SN-CM, utilizzando sia cellule murine che organoidi umani su chip, e ricostruzione 3D della rete SN in cuori murini e umani chiariti. Sulla base dei nostri solidi dati, in un passo verso la traslabilità, testeremo l'effetto terapeutico dell'antagonismo NPY/NA in vivo, somministrato per via sistemica o tramite nanocarrier inalati (WP2). Combinando analisi proteomiche e trascrittomiche su larga scala, screening ad alto rendimento in vitro e trapianto di midollo osseo in modelli murini di nuova generazione, il WP3 definirà il ruolo delle mutazioni AC sulla biologia delle cellule immunitarie e sul crosstalk tra cellule immunitarie e SN.

I risultati saranno controllati dall'analisi di biopsie miocardiche e liquide, campioni cardiaci autoptici e campioni di AC esistenti raccolti presso l'istituto di anatomia patologica di Padova. I nostri risultati aumenteranno la conoscenza sulla patogenesi dell'AC, aprendo la strada all'identificazione di nuovi target terapeutici e allo sviluppo di terapie meccanicistiche per migliorare la salute cardiovascolare e ridurre la mortalità nella popolazione giovane.

  "Understanding and dissecting the role of Tumor microEnvironment of Lung Adenocarcinoma in the era of precision medicine" (TELUAD)
Principal Investigator: Prof.ssa Fiorella Calabrese

Lung cancer is the worldwide leading cause of cancer-related death. Non-small-cell lung cancer particularly lung adenocarcinoma (LUAD) is the most common form with targetable genetic alterations. The discovery of cancer cell ability to silence the anti-tumor immune response has opened the door to the development of immune checkpoint inhibitory (ICI) therapies, mainly targeting the programmed cell death PD-1/PD-L1 (PD-ligand) axis. However, the treatment still faces many challenges even in highly selected patients. The research hypothesis is that other tumor microenvironment (TME) components, in addition to PD-L1 axis, may influence and modulate the response to ICI treatment. The primary aim is to carefully investigate immune TME in LUAD tissues of responders and non-responders to ICI treatment. A secondary aim is to evaluate if new genetic alterations are differently present in responders versus non-responders, thus exploring if the PD-L1 neoplastic cell expression is constitutive or an epiphenomenon. An exploratory aim is to develop a more objective computational analysis of TME components. Moreover, to better understand how tumor genetic background influences circulating and tissue cytokine/chemokine milieu and TME composition and function, we will use innovative preclinical models, such as patient-derived organoids (PDO). This research is a retrospective and prospective longitudinal multicentric study involving surgically resected LUAD patients treated with ICIs in case of recurrence/metastasis. Immune TME components will be evaluated by immunohistochemistry, including quantification and precise spatial organization. Next-generation sequencing with the 56-gene panel and TME computational analysis will be additionally performed. An orthotopic animal model of LUAD will be used to replicate clinical findings. Anti-PD-1 treatment and possible different combinations will be planned to deeply understand key targets and optimize new treatments. Appropriate statistical tests will be applied in clinical and experimental study. The main expected result is to identify key TME components, in addition to PD-L1, that may influence immunotherapy efficacy. The results could make significant contributions to the field of lung cancer leading to a better patient stratification and outcome, also improving cost-effectiveness and efficiency of the healthcare system.

  "Comprendere e analizzare il ruolo del microambiente tumorale nell'adenocarcinoma polmonare nell'era della medicina di precisione" (TELUAD)
Responsabile Scientifico: Prof.ssa Fiorella Calabrese

Il cancro ai polmoni rappresenta la principale causa di morte a livello mondiale. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule, in particolare l'adenocarcinoma polmonare (LUAD), è la forma più comune e presenta alterazioni genetiche potenzialmente trattabili. La scoperta della capacità delle cellule tumorali di silenziare la risposta immunitaria anti-tumorale ha aperto la strada allo sviluppo di terapie inibitorie dei checkpoint immunitari (ICI), che mirano principalmente all'asse della morte cellulare programmata PD-1/PD-L1 (ligando PD). Tuttavia, questo trattamento presenta ancora molte sfide, anche in pazienti altamente selezionati. L'ipotesi di ricerca è che altri componenti del microambiente tumorale (TME), oltre all'asse PD-L1, possano influenzare e modulare la risposta al trattamento con ICI. L'obiettivo principale è analizzare attentamente il TME immunitario nei tessuti LUAD di pazienti responder e non-responder al trattamento con ICI. Un obiettivo secondario è valutare se nuove alterazioni genetiche siano diversamente presenti tra responder e non-responder, esplorando quindi se l'espressione di PD-L1 nelle cellule neoplastiche sia costitutiva o un epifenomeno. Un obiettivo esplorativo è sviluppare un'analisi computazionale più obiettiva dei componenti del TME. Inoltre, per comprendere meglio come il background genetico tumorale influenzi il profilo delle citochine/chemochine circolanti e tissutali e la composizione e funzione del TME, verranno utilizzati modelli preclinici innovativi, come gli organoidi derivati dai pazienti (PDO). Questa ricerca è uno studio longitudinale, multicentrico, sia retrospettivo che prospettico, che coinvolge pazienti affetti da LUAD sottoposti a resezione chirurgica e trattati con ICI in caso di recidiva/metastasi. I componenti immunitari del TME saranno valutati mediante immunoistochimica, compresa la quantificazione e la precisa organizzazione spaziale. Verranno inoltre effettuate il sequenziamento di nuova generazione (NGS) con il pannello di 56 geni e l'analisi computazionale del TME. Un modello animale ortotopico di LUAD sarà utilizzato per replicare i risultati clinici. Il trattamento con anti-PD-1 e possibili combinazioni verranno pianificati per comprendere in modo approfondito i bersagli chiave e ottimizzare nuovi trattamenti. Saranno applicati test statistici appropriati nello studio clinico ed esperimentale. Il principale risultato atteso è l'identificazione di componenti chiave del TME, oltre al PD-L1, che possano influenzare l'efficacia dell'immunoterapia. I risultati potrebbero apportare contributi significativi nel campo del cancro ai polmoni, portando a una migliore stratificazione dei pazienti e a un miglioramento dei risultati clinici, incrementando anche l'efficacia in termini di costi e l'efficienza del sistema sanitario.

  "An integrated human-in vitro approach to explore the role of miRNAs in the allergic asthma"
Principal Investigator: Dott. Filippo Liviero

Bronchial asthma is a heterogeneous and chronic disease of the lower airways that affects about 300 million people worldwide. The most common and well-studied form of bronchial asthma is the allergic one. In particular, occupational allergic asthma, resulting from sensitization of the airways to chemical agents, is clearly an important health problem with relevant clinical consequences. The main pathological feature of allergic asthma is the complex interaction between cells of the respiratory system, immune cells, and immunological mediators. Recent evidence has reported alterations in the expression of microRNAs (miRNAs) in a variety of lung diseases, including allergic asthma. Indeed, numerous miRNAs have been associated with asthma and airway inflammation, but the identification of possible targets has not yet been fully clarified. The central hypothesis of this project is that miRNAs play a key role in the activation and maintenance of allergic asthma through the active involvement of the immune system. The specific aim of this project, entirely based on human-derived cells, is to identify miRNA patterns and consequently which specific targets are involved in the interaction between the respiratory system and the immune system in allergic asthmatic disease. The project is structured in two parts: a first part based on cell cultures and the development of an in vitro method; and the second part based on biological samples from patients suffering from occupational allergic asthma. For the in vitro approach, human lung epithelial cells, Calu-3, will be exposed to known respiratory sensitizers through an aerosol system, Cloud Alpha System (VITROCELL® Systems). MicroRNA panels will be performed under control conditions and under exposure conditions in order to better study the miRNAs possibly involved in allergic asthma and/or in the activation/deregulation of the immune system. For the human part, a broad evaluation of miRNAs will be conducted in asthmatic patients and healthy donors, through the analysis of miRNA expression in blood microvesicles and exhaled breath condensate. The translational potential of the project is due to the use of a cell culture model and human samples. Furthermore, the implementation of miRNA patterns could be useful as a prevention tool (biomarkers for diagnosis) of allergic asthma.

  "Un approccio integrato in vitro per l'uomo al fine di esplorare il ruolo dei miRNAs nel l'asma allergica"
Responsabile scientifico: Dott. Filippo Liviero

L’asma bronchiale è una malattia eterogenea e cronica delle basse vie aeree che colpisce circa 300 milioni di persone in tutto il mondo. La forma di asma bronchiale più comune e ben studiata è quella allergica. In particolare, l’asma allergica occupazionale, derivante dalla sensibilizzazione delle vie respiratorie ad agenti chimici è chiaramente un importante problema sanitario con rilevanti conseguenze cliniche. La principale caratteristica patologica dell’asma allergica è la complessa interazione tra cellule del sistema respiratorio, cellule immunitarie e mediatori immunologici. Evidenze recenti hanno riportato alterazioni nell’espressione dei microRNA (miRNA) in una varietà di malattie polmonari, inclusa l’asma allergica. Infatti, numerosi miRNA sono stati associati all’asma e all’infiammazione delle vie aeree, ma l’identificazione dei possibili target non è ancora stata completamente chiarita. L’ipotesi centrale di questo progetto è che i miRNA svolgano un ruolo chiave nell’attivazione e nel mantenimento dell’asma allergico attraverso il coinvolgimento attivo del sistema immunitario. Lo scopo specifico di questo progetto, interamente basato su cellule di derivazione umana, è identificare i pattern di miRNA e di conseguenza quali target specifici sono coinvolti nell’interazione tra il sistema respiratorio e il sistema immunitario nella malattia asmatica di tipo allergico. Il progetto è strutturato in due parti: una prima parte basata su colture cellulari e sulla messa a punto di un metodo in vitro; e la seconda parte basata su campioni biologici provenienti da pazienti affetti da asma allergica occupazionale. Per l’approccio in vitro le cellule epiteliali del polmone umano, Calu-3, saranno esposte a noti sensibilizzanti respiratori attraverso un sistema di aerosol, Cloud Alpha System (VITROCELL® Systems). Verranno eseguiti pannelli di microRNA in condizioni di controllo e in condizioni di esposizione al fine di studiare meglio i miRNA possibilmente coinvolti nell’asma allergico e/o nell’attivazione/deregolazione del sistema immunitario. Per la parte umana, verrà condotta un’ampia valutazione dei miRNA nei pazienti asmatici e donatori sani, attraverso l’analisi dell’espressione dei miRNA nelle microvescicole del sangue e nel condensato del respiro esalato. Il potenziale traslazionale del progetto è dovuto all’uso di un modello di coltura cellulare e di campioni umani. Inoltre, l’implementazione di pattern di miRNA potrebbe essere utile come strumento di prevenzione (biomarcatori per la diagnosi) dell’asma allergica.

  "The mechanistic link between genetic substrate and immune reactions in inflammatory cardiomyopathies"
Responsabile scientifico: Prof.ssa Kalliopi Pilichou

Background
Inflammatory cardiomyopathies (ICM) encompass a group of cardiac disorders characterized by inflammation that contributes to myocardial remodeling, impaired cardiac function, and potentially life-threatening arrhythmias. These include myocarditis, familial dilated cardiomyopathy (DCM), and arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM). Myocarditis refers to inflammation of the heart muscle caused by infectious agents or non-infectious triggers (e.g., autoimmune diseases or hypersensitivity to toxic substances). Diagnosis relies on endomyocardial biopsies and
immunological testing. DCM is characterized by ventricular dilation and reduced systolic function. More than half of patients display evidence of cell-mediated immunity, including proinflammatory cytokines and lymphocytic infiltration, alongside humoral immune activation marked by autoantibodies against beta-1 adrenergic receptors. ACM is characterized by fibro-fatty replacement of the myocardium, which predisposes patients to severe arrhythmias. Studies have identified immune activation and specific autoantibodies against cardiac intercellular junctions as key contributors. Inflammatory processes are frequently observed in DCM and ACM, making their distinction from myocarditis clinically challenging. It is also hypothesized that mutations in structural proteins may render the myocardium more susceptible to infection, leading to the progression of myocarditis into DCM or ACM.
Study Hypothesis
This study aims to explore how genetic factors influence susceptibility to immune-mediated disease in patients with ICM.
Expected outcomes
Our project foresees to broaden the current vision of ICM pathogenesis, focusing on the interplaybetween inflammation and genetic background in disease onset and progression. Based on the literature and on a large set of preliminary data, obtained by the applicants, our project will ascertain the very novel hypothesis that accumulation of genetic defects turns on inflammatory infiltrates to be translated in different ICM variants based on the immune system background of each individual. Along with the scientific relevance of understanding the complex cellular interplay driving ICM
pathogenesis, this study has a significant social impact given the dramatic consequences of ICM in the young population and the lack of therapies to prevent its progression. The findings of the project are expected to have a high translational impact. The translation of the expected results to patients healthcare has the potential to reduce the incidence of SCD, improve patients’ life span and quality of life. Moreover, the discovery of new effective therapeutic approaches will also reduce the high costs now afforded by the national health system, typical of a severe progressive degenerative disease as ACM (e.g. symptomatic drugs, repetitive arrhythmias ablations, cardioverter devices implants, hospitalization for heart failure, heart transplant).

  "Il legame meccanicistico tra substrato genetico e reazioni immunitarie nelle cardiomiopatie infiammatorie"
Responsabile scientifico: Prof.ssa Kalliopi Pilichou

Stato dell’arte
Le cardiomiopatie infiammatorie (ICM) comprendono un gruppo di disturbi cardiaci caratterizzati da un’infiammazione che contribuisce al rimodellamento del miocardio, alla disfunzione cardiaca e a potenziali aritmie letali. Tra queste si annoverano la miocardite, la cardiomiopatia dilatativa familiare (DCM) e la cardiomiopatia aritmogena (ACM). La miocardite si riferisce all’infiammazione del muscolo cardiaco causata da agenti infettivi o fattori non infettivi (ad esempio, malattie autoimmuni o ipersensibilità a sostanze tossiche). La diagnosi si basa su biopsie endomiocardiche e test immunologici. La DCM è caratterizzata da dilatazione ventricolare e ridotta funzione sistolica. Più della metà dei pazienti mostra segni di immunità cellulo-mediata, inclusa la presenza di citochine proinfiammatorie e infiltrati linfocitari, insieme ad attivazione umorale, evidenziata dalla presenza di autoanticorpi contro i recettori beta-1 adrenergici. L’ACM è caratterizzata dalla sostituzione fibro-adiposa del miocardio, che predispone i pazienti a gravi aritmie. Recenti studi hanno identificato l’attivazione immunitaria e autoanticorpi specifici contro le giunzioni intercellulari cardiache come fattori chiave. I processi infiammatori sono frequentemente osservati sia nella DCM che nell’ACM, rendendo spesso difficile distinguerle clinicamente dalla miocardite. Inoltre, si ipotizza che mutazioni in proteine strutturali possano rendere il miocardio più
vulnerabile alle infezioni, favorendo la progressione della miocardite in DCM o ACM.
Ipotesi di Studio
Questo studio mira a esplorare come i fattori genetici influenzino la suscettibilità alle malattie immuno-mediate nei pazienti con ICM.
Risultati Attesi
Il progetto si propone di ampliare la comprensione della patogenesi delle ICM, concentrandosi sull’interazione tra infiammazione e background genetico nell’insorgenza e nella progressione della malattia. Basandosi sulla letteratura e su un ampio set di dati preliminari raccolti dai proponenti, lo studio intende verificare una nuova ipotesi secondo cui l’accumulo di difetti genetici attiva infiltrati infiammatori, che si traducono in diverse varianti di ICM in base al sistema immunitario di ciascun individuo. Oltre alla rilevanza scientifica di comprendere le complesse interazioni cellulari che guidano la patogenesi delle ICM, questo studio ha un significativo impatto sociale, data la gravità delle conseguenze delle ICM nella popolazione giovane e la mancanza di terapie per prevenirne la progressione. I risultati del progetto sono attesi avere un forte impatto traslazionale.  L’applicazione dei risultati alla pratica clinica potrebbe ridurre l’incidenza della morte cardiaca improvvisa (SCD), migliorare l’aspettativa e la qualità di vita dei pazienti. Inoltre, la scoperta di nuove strategie terapeutiche efficaci potrebbe ridurre i costi sanitari associati a una malattia degenerativa severa come l’ACM (ripetute ablazioni per aritmie, impianti di defibrillatori, ospedalizzazioni per insufficienza cardiaca, trapianti di cuore).